1.4.1ABTS——分光光度計法

　　以ABTS為底物測定漆酶酶活是目前國外較為常見的方法之一。它有如下優點：(1)ABTS易溶于水，在室溫下放置6個月仍較穩定。(2)其反應只有一步，即從ABTS到它的陽離子自由基。ABTS的陽離子自由基在水溶液中呈淺藍綠色，且比較穩定，通常在幾個小時或幾天之內是穩定的。(3)在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩爾吸光系數較高，說明以其為底物測定的靈敏度較高。(4)到目前為止，還未有報道稱ABTS有致癌作用、誘變作用或是強烈的毒性。

　　WolfendenandWilson分別對5mmol/LABTS加入20μmol/L的抗壞血酸鹽的測定溶液，于不同波長進行了光譜掃描，發現純ABTS呈淺藍綠色，且在415nm處有吸收峰;而加了抗壞血酸鹽的溶液為無色，在415nm處無吸收峰。ABTS的較大吸收峰在340nm，ABTS的陽離子自由基的較大吸收峰在415nm.由此推斷，在ABTS的溶液中含有較少的ABTS陽離子自由基，它們在更強的還原劑作用下被還原為ABTS。以ABTS為底物進行漆酶的定量分析，通常在420nm下測定3min內吸光度的變化。用這種底物進行定量分析有一個缺點，即ABTS陽離子自由基溶液的吸光度受溶液中未反應的ABTS濃度的影響。這就產生了一個問題：420nm下的摩爾吸光系數36000L/(mol•cm)是在純ABTS陽離子自由基的條件下求得的，而在實際測定反應中，ABTS是過量的，這就導致人們低估了酶活。這種影響不能忽視，因為反應終止時，溶液中至少還要有1mmol/L的ABTS。盡管用ABTS為底物存在上述問題，但是它仍是漆酶酶活測定的較好底物之一。一般以ABTS為底物，采用Glycine2HCl緩沖體系、乙酸2乙酸鈉緩沖體系或檸檬酸鹽2磷酸鹽緩沖體系。如果菌種產生過氧化氫，為了準確測定，需加入一定量的過氧化氫酶，用以破壞過氧化氫。因為在代謝過程中，菌體自身產生過氧化氫可激發木質素過氧化物酶與錳過氧化物酶對ABTS的氧化。

　　1.4.2丁香醛連氮——分光光度計法

　　丁香醛連氮(Syringaladazine)也是漆酶酶活測定較為常見的底物之一。以丁香醛連氮為底物是將其氧化為相應的醌，它的摩爾吸光系數為65000L/(mol•cm)。其摩爾吸光系數較大，可見用它定性測定漆酶的酶活具有較高的靈敏度。采用McIlvaine緩沖體系(pH=5.0)，在525nm處測定吸光度的增加。

　　1.4.3二茂鐵——分光光度計法

　　以二茂鐵(Fe2H)為底物的反應方程式：Fe2H+e2Cu2+e2Cu++[Fe2H]+e2Cu++4H++O2=e2Cu2++2H2O-[Fe2H]溶于水，呈藍色，在617nm處出現特征吸收峰，Fe2H不對其發生干擾。因此，以二茂鐵為底物，用分光光度法測定漆酶活性準確度較高，重復性較好。由于二茂鐵不溶于水，因此季立才等選親水性和疏水性都較好的DGBE作溶劑，與0.1mol/L磷酸鹽緩沖液以1∶5體積比混合后，使二茂鐵以一定濃度溶解，同時保持漆酶活性。季立才等從生漆中分離、純化漆樹漆酶，并經CM2SephadexC50柱層析，得藍色酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個組分，以二茂鐵為底物，用DGBE2磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)，在617nm處測定吸光度的增加。該方法無副產物干擾，簡便、準確、易行。但目前使用并不廣泛，故用這種方法測定的酶活力的可比性不高。.還有其它一些用于漆酶酶活測定的底物，無論用哪一種底物進行測定，都有其自身的優勢和不足。

　　1.4.4微量熱法

　　望天志采用LKB22107Batch型微量熱系統，在溫度為298.15K，pH=7.4的條件下，測定了漆酶催化氧化底物3，4，5-三羥基苯甲酸、鄰苯三酚、鄰甲氧基酚的活性，用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制成pH=7.4的緩沖液。該法操作簡單，所用樣品量少，不需要光學透明的樣品，對酶的懸浮液也能直接測定，對反應體系沒有任何限制或干擾。

　　1.4.5脈沖激光光聲法

　　閻宏濤等采用脈沖激光光聲法測定了漆酶酶活。試驗了入射激光能量、激光照射時間和溫度變化等因素對漆酶活性的影響;建立了測定漆酶的光聲分析方法，檢測限為3μg，是一種高靈敏度的生物樣品分析方法。

　　3.3.1ABTS法測酶活

　　3.3.1.1主要試劑與儀器

　　主要試劑：

　?、?mmol/LABTS溶液，ABTS為美國Sig2ma公司產品，稱取0.0274gABTS，用蒸餾水定容至100mL，置于棕色瓶備用;

　?、艸ac-NaAc(pH4.5)緩沖溶液，18gNaAc，9.8mlHAc，用蒸餾水定容至1L，用pH計校準其pH值。

　　主要儀器：

　?、臮V-2100型紫外-可見分光光度計，UNICO尤尼柯(上海)儀器有限公司;

　?、艱ELTA320型pH計，METTLERTOLEDO梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

　　3.3.1.2漆酶適pH值的測定方法

　　在25℃時，以2mLBritton2Robinson緩沖溶液，外加1mL用蒸餾水稀釋104倍的漆酶液為空白;先設定參數，使吸光度自動歸零。取1mL相應pH值的Britton2Robinson緩沖溶液，用蒸餾水1mL稀釋104倍的漆酶液，再加1mL的1mmol/LABTS溶液于比色皿啟動反應，同時用UV-2201型紫外-可見分光光度計的TIME2COURSE程序記錄吸光度在420nm波長處4min內的時間歷程，取該曲線較初部分的斜率為酶反應的速度，酶反應速度較大時對應的pH值為漆酶的較適pH值。

　　查文獻知漆酶酶活較適pH為4.5。

　　3.3.1.3漆酶稀釋倍數及酶活力的測定方法

　　取酶液0.1ml，加入Hac-NaAc(pH4.5)緩沖液2.5ml，混勻，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s讀取一次420nm下吸光值。共讀取6～7個數值。以經驗判斷，若吸光值增長迅速，則將酶液稀釋2～5倍再次測定，直至吸光值數值變化不是太快，且數值均在0.2～0.8之間。酶活的計算：吸光度變化的斜率×4000×稀釋倍數。